Cryo-TEM

Análisis por microscopia de baja temperatura (cryo-EM) de materiales orgánicos e híbridos

Las técnicas de TEM requieren siempre que la columna del microscopio se encuentre en alto vacío, de modo que las muestras a observar deben estar secas. Cryo-TEM es una buena alternativa ya que permite la observación directa de muestras líquidas en su estado original: las muestras son vitrificadas en etano o propano líquido y analizadas en el microscopio a baja temperatura. El método de vitrificación está basado en un enfriamiento ultra-rápido que evita la formación de hielo cristalino. La fina capa de hielo amorfo, formada durante la vitrificación, protege al material del daño directo por irradiación del haz de electrones.

Vitrobot© de Thermofisher para vitrificación automática (izquierda). La rejilla vitrificada con la muestra se maneja en atmósfera de nitrógeno líquido, y después es colocada en un portamuestras de baja temperatura o Cryo-holder de Gatan (derecha)

Se trata de una técnica ideal para la observación de proteínas, polímeros, hidrogeles, vesículas orgánicas, micelas, objetos de material mixto (orgánico/metálico) o pequeñas células (idealmente menores de 1µm). Entre otras ventajas, evita los artefactos que resultan por la adición de agentes de contraste en una preparación y observación convencional.

Ejemplos de Vitrificación y observación por cryo-TEM de vesículas poliméricas(izquierda), Nanoribbon polimérico (derecha). Ambas muestras pertenecen al grupo de Cristales Líquidos y Polímeros del INMA.

La vitrificación tiene lugar en un Vitrobot de Thermofisher: Una gota de 3 µl de una suspensión acuosa del material, a la concentración adecuada, es colocada sobre una rejilla Quantifoil de Carbono para TEM. El exceso de agua es eliminado en el vitrobot mediante papel de filtro y la rejilla es sumergida en etano líquido. Las muestras son transferidas en nitrógeno líquido a un portamuestras de baja temperatura (Cryo-holder de Gatan). De ese modo las muestras son manipuladas y analizadas a una temperatura de T=100K.
Como los materiales organicos son muy sensibles al haz de electrones, el software de baja dosis (low-dose) deThermofisher se utiliza durante el análisis para controlar la dosis electrónica, y así evitar daño por irradiación sobre la muestra.

Todas las técnicas analíticas del microscopio, como la Difracción de electrones y las espectroscopias EELS y EDS pueden utilizarse en condiciones de baja temperatura para obtener información adicional sobre la estrctura y composición química de las muestras vitrificadas.

(Izquierda) Imagen STEM-HAADF de una esfera de alginato que contiene nanopartículas de magnetita (Medio) Espectro EELS de los umbrales de energía O K and Fe L2,3. (Derecha) Patrón de difracción de las nanopartículas de Fe3O4, obtenido en condiciones de baja temperatura (muestra de Laura de Matteis, INMA). Para más información: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ppsc.201300153