Preparación de muestras

Las muestras no conductoras requieren de un recubrimiento metálico o de carbono y esto se consigue gracias al sistema de bajo vacío de Leica EM ACE200, con el que se pueden recubrir muestras de superficie irregular, gracias a un «stage» con rotación.

Para TEM se requieren muestras delgadas que sean “transparentes” a los electrones. Uno de los métodos consiste en el adelgazamiento mecánico de la muestra de forma controlada. Esto se realiza en el laboratorio mediante la preparación de secciones transversales y vistas planas mediante pulido con trípode en combinación con un pulido iónico de la superficie, a bajo ángulo y baja energía. La ultramicrotomía es otra técnica para producir secciones finas, entre 50-70 nm de espesor, de materiales blandos (biológicos, inorgánicos y composites). Las muestras se pueden cortar en un rango de temperatura entre -180 °C (crio-ultramicrotomía) y temperatura ambiente dependiendo de las características del material. En el caso de muestras biológicas (de tejidos, células, bacterias, etc.), se llevan a cabo dos tipos de preparaciones en función de los requerimientos de la muestra y del objetivo de caracterización:

-Tratamiento estándar: las muestras se fijan (ej. con glutaraldehído y tetróxido de osmio), se deshidratan y embeben en resina epoxy antes de ser cortadas con el ultramicrotomo.

-Técnica Tokuyasu: el material fijado se embebe en gelatina, se infiltra con sacarosa, se congela posteriormente en nitrógeno líquido y se secciona mediante crio-ultramicrotomía. Es además el método más fiable y sensible para realizar técnicas de inmunomarcaje.

Los materiales biológicos o poliméricos que vayan a caracterizarse mediante SEM o TEM, requieren en ocasiones de una tinción con metales pesados para incrementar su contraste y mejorar su observación y es por ello que en el LMA disponemos de diferentes agentes de tinción (tetróxido de osmio y de rutenio, acetato de uranilo, citrato de plomo, ácido fosfotúngstico, metilamina de Vanadio y metilamina de Wolframio).

Además, en el LMA es posible vitrificar muestras y analizarlas en condiciones criogénicas. Cryo-TEM es una buena alternativa para la observación directa de muestras líquidas en su estado original: las muestras se vitrifican en etano líquido y se analizan en el microscopio a baja temperatura. El método de vitrificación se basa en un enfriamiento muy rápido de la muestra que impide la formación de hielo cristalino. Además, la fina capa de de hielo amorfo que se forma durante el proceso de vitrificación protege el material de los daños causados por los haces de electrones. El proceso de vitrificación se realiza en un Vitrobot© de Thermofisher: Una gota de 3 µl de una suspensión acuosa del material se coloca en una rejilla de carbono TEM Quantifoil©, el exceso de agua se elimina en el Vitrobot© con papel de filtro y la rejilla se sumerge por congelación en etano líquido. A continuación, las muestras se transfieren a un criotransfer TEM Gatan, equipado con un depósito de nitrógeno líquido. De este modo, las muestras se manipulan y se observan a T=100K. El sistema de bajo vacío de Leica EM ACE200 dispone de la opción de glow discharge para hacer las rejillas temporalmente hidrofílicas.